ABSTRACT الخلاصة مجلة التربية والعلم - المجلد (21) العدد (3) لسنة تم عزل وتشخيص بكتريا Rhizobium leguminosarum bv.viciae

Transcript

1 مجلة التربية والعلم - المجلد (21) العدد (3) لسنة 2008 hizobium leguminosarum bv.viciae تقدير حساسية بكتريا لمجموعة مضادات البيتا لاكتام د. محمود زكي الحس و الطاي ي ا براهيم محمد كلية العلوم / قسم علوم الحياة وتقاناتها البيي ة كلية علوم جامعة الموصل جامعة الموصل الاستلام 06 / 06 / 2007 القبول 03 / 12 / 2007 ABSTACT hizobium leguminosarum bv.viciae was isolated and identified from root nodules of Vicia faba L. plant. Its susceptibility to 14 types of β-lactam antibiotics was tested by disk diffusion method. The isolate was resistant to the following antibiotics; Amoxicillin, Carbencillin, Cephalexin, Cephradine, Cefuroxime, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefixime, Ceftizoxime, Cefepime, and Aztreonam, while it was sensitive to only three antibiotics including; Imipenem, Cefoperazone and Ceftriaxone. The occurrence of multiple drug resistance in a soil bacterium, that is not a pathogen, suggests that chemotherapeutic use of antibiotics is not required for the development of multiple drug resistance. This may considers as a defense line to protect plant roots from pathogenic soil microorganisms. الخلاصة تم عزل وتشخيص بكتريا hizobium leguminosarum bv.viciae من العقد الجذرية لنبات الباقلاء.L Vicia faba ومن ثم اختبار حساسيتها ل( 14 ) نوع ا من مضادات البيتا -لاكتام بطريقة الانتشار بالا قراص. وا ظهرت هذه العزلة مقاومة واضحة ل( 11 ) نوع ا من المضادات المدروسة شملت Cephradine, Amoxicillin, Carbencillin, Cephalexin, Cefuroxime, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefixime, Ceftizoxime, Cefepime, 66

2 تقدير حساسية بكتريا... hizobium leguminosarum bv.viciae Imipenem, في حين كانت العزلة حساسة لثلاثة مضادات فقط هي Aztreonam,.Cefoperazone, Ceftriaxone ا ن المقاومة المتعددة للمضادات التي ا ظهرتها هذه البكتريا المثبتة للنتروجين الجوي يشير ا لى ا ن الاستخدام الواسع للمضادات ليس شرط ا لظهور وتطور المقاومة المتعددة للمضادات بين البكتريا وقد يمثل وسيلة دفاعية تبديها جذور النباتات لحمايتها من الا حياء المجهرية الممرضة الموجودة في التربة. يتكون مجتمع الرايزوسفير ا ساس ا من المقدمة للا حياء المجهرية والعلاقات الناشي ة بينها سواء كانت مفيدة ا حياء مجهرية غير ممرضة ا و ضارة قد يكون لها ولكن الكثافة العددية ا همية خاصة بالنسبة للكاي نات الممرضة المنتقلة عن طريق التربة نظر ا لا ن مثل هذه الكاي نات لابد ا ن تتغلغل ا لى منطقة الرايزوسفير لا حداث العدوى. ونظر ا لاحتواء الرايزوسفير على كثافة ا على من الا حياء المجهرية مقارنة تبدو ا كثر وضوح ا (2,1). ا كثر ا ن گرام ومن بين تثبيت النتروجين المتخصص بالتربة المجاورة فان علاقة التضاد Antagonism بين هذه الكاي نات الا نواع البكتيرية استجابة لتا ثيرات الجذور هي العصيات القصيرة السالبة لصبغة الا جناس الجوي تكافلي ا الذي ينتمي الشاي عة في هذه المنطقة هي ا لى ال بكتريا عن طريق تكوين العقد الجذرية البقولية العاي لة hizobium وجود ا ن كما (3). جذور على هذه البكتريا المسو ولة عن العاي ل النباتي في منطقة الرايزوسفير يعمل على حماية جذور النباتات من هايفات الفطريات الممرضة التي تتطفل على النبات العاي ل (1). ونظر ا لوجود هذه البكتريا في بيي ة الرايزوسفير الحاوية على كميات كبيرة من الا حياء المجهرية بمختلف قد تنتج هذه البكتريا مواد ذات ا نواعها فلابد من نشوء علاقات مختلفة فيما بينها كالتنافس والتضاد تا ثيرات تثبيطية للا حياء المجهرية ا ذ الا خرى كالفطريات الممرضة وفي نفس الوقت فا نها قد تمتلك ا ليات معينة تمكنها من مقاومة السموم والمواد الضارة المنتجة من الا حياء المجهرية الا خرى (2,1). تعد مضادات البيتا-لاكتام β-lactam Antibiotics ا حدى المجاميع الري يسة للمضادات الحيوية وهي تتكون من عدة مجاميع فرعية حسب الكاي نات المنتجة لها وطيفها المضاد للبكتريا وصفاتها الدواي ية وغيرها. تعمل ويكون على تثبيط بناء طبقة الببتيدوكلايكان تا ثير هذه المضادات قات لا للبكتريا Bactericidal Effect Peptidoglycan Layer ا ذ المميزة لجدر البكتريا مما 67

3 د. محمود زكي الحس و & محمد ا براهيم الطاي ي يو دي spp. ا لى تحلل الخلايا الجرثومية وموتها (5,4) Penicillium و Cephalosporium spp. وتعد الفطريات الا حياء ا كثر من لمضادات البيتا لاكتام وهي عادة ما تتواجد في التربة وتنتج هذه المركبات لاسيما المجهرية بوصفها ا نواع ا نتاج ا نواتج عرضية لفعاليتها الا يضية وقد استخدمت هذه المواد في ا نتاج المضادات الحيوية بعد تنقيتها وتحويرها كيمياي ي ا لا نتاج مضادات ا كثر فاعلية لغرض استخدامها في علاج الا صابات البكتيرية التي تصيب علاج كثير من الا نسان والحيوان على حد سواء الحالات المرضية الخطيرة فا ن.(7,6) بشكل واسع يمثل تحدي ا جد ي ا يواجه استخدام هذه المضادات سريري ا (4). يهدف البحث الحالي البيتا لاكتام لاسيما تكوين العقد الجذرية ا نها ا لى التعرف على وعلى الرغم من فعالية هذه المضادات في ظهور السلالات البكتيرية المقاومة لها وانتشارها بكتريا موقف hizobium من الكاي نات البيي ية التي تعرف بعلاقتها النافعة للنباتات البقولية المثبتة للنتروجين الطبيعي في التربة وتماسها المباشر مع وا تاحته الجوي الكاي نات المنتجة للمضادات كالفطريات والاكتينومايسيتات لمضادات من خلال للنبات وفي نفس الوقت فان تواجدها الا حياء المجهرية المختلفة المتواجدة في التربة بما فيها قد يطرح الحيوية وذلك لغرض بقاي ها واستمرارها بالقيام بدورها الحيوي للنبات. ا مكانية مقاومتها للمضادات عزل بكتريا المواد وطراي ق العمل hizobium leguminosarum bv.viciae عزلت بكتريا. leguminosarum bv.viciae نبات الباقلاء. L.Vicia faba واستو صلت العالقة بها. الاثيلي الكحول الجذور الحاوية على تم فصل عقدة جذرية تم العقد الباقلاء نباتات قلع من العقد الجذرية الموجودة في جذور (10) بعمر (%95) كامل ة ا سابيع من التربة الجذرية ثم غسلت جيد ا بالماء للتخلص من حبيبات التربة كبيرة الحجم لمدة دقيقة واحدة نسبي ا (8) (بقطر 4-3 ملم تقريب ا) غسلت بعدها بماء معقم وعقمت بغمرها في لا زالة اثر الكحول. قطعت العقدة ا لى نصفين بواسطة مشرط معقم واخذ احدهما وا ضيف ا ليه بضع قطرات من الماء وسحق المعقم بواسطة قضيب زجاجي معقم ا ذ ا صبح الماء عكر ا وذا لون ابيض نتيجة لتحرر محتوى العقدة الجذرية. تم بعدها نقل حملة لوب من المعلق الناتج وفرشها على الوسط الصلب Yeast Extract Mannitol (YEM) Agar وبواقع مكررين حضنت الا طباق في درجة حرارة م لمدة 5 ا يام (9,8). 68

4 م تقدير حساسية بكتريا... hizobium leguminosarum bv.viciae التلقيح الاصطناعي لبذور الباقلاء ببكتريا. leguminosarum bv.viciae (%1) عقمت التربة ( كغم تقريب ا) باستخدام محلول الفورمالين الساي ل ا يام. لمدة ثلاثة تركت بعدها التربة لمدة يومين للتهوية. استخدام تم سنادين بلاستيكية لا جراء سم بقطر( 20 ) التجربة. وضعت التربة المعقمة داخل السنادين ( 500 غم تقريب ا/سندان) ولقحت بالبكتريا بواقع نصف طبق صلب مزروع بالبكتريا الفتية بطريقة التخطيط لكل سندان (يخلط مع التربة) ثم تركت لمدة ثلاثة ا يام مع مراعاة مستوى الرطوبة (10) كما تم عمل معاملة سيطرة غير ملقحة (%1) بالبكتريا زرعت السنادين ببذور الباقلاء المعقمة بمحلول هيبوكلورايت الصوديوم ثم (40) غسلها بالماء المعقم (11). بعد انتهاء فترة النمو يوم ا حصدت النباتات من جذورها وتم التحري عن تكوين العقد الجذرية. اختبار الحساسية للمضادات الحيوية ا جري اختبار الحساسية ل( 14 ) نوع ا من مضادات البيتا لاكتام بطريقة الانتشار تم الحصول على المضادات بشكل ا قراص.(13) بالا قراص Disk Diffusion Method جاهزة (شركة Bioanalyse التركية) وشملت مضادات السيفالوسبورينات با جيالها الا ربعة وهي Cephradine(µg) مضادا Cephalexin(µg) ممثلة لسيفالوسبورينات الجيل الا ول ومضاد Cefuroxime(µg) كا حد سيفالوسبورينات الجيل الثاني واستخدمت عدة مضادات تابعة لسيفالوسبورينات الجيل الثالث وهي Ceftriaxone(µg) Cefotaxime(µg), Ceftazidime(µg), Ceftizoxime(µg), Cefixime(5µg), Cefoperazone(75µg) واستخدم مضاد Cefepime(µg) ممث لا لسيفالوسبورينات الجيل Carbencillin(100µg) الرابع وبالنسبة للبنسلينات استخدم مضادا Amoxicillin(25µg) كما استخدم مضاد Imipenem(10µg) ممث لا لمضادات ال Carbapenems في حين استخدم.Monobactams مضاد Aztreonam(µg) كا حد مضادات ال اجري الاختبار حسب القياسات المختبرية السريرية (CLSI) Clinical Laboratory Standards Institute (سابق ا باستخدام وسط ا كار مولر هنتون الخاص باختبارات الحساسية للمضادات الحيوية. (NCCLS 8 اللقاح 10x1 الا طباق لقحت بالعزلة البكتيرية (تركيز خلية/مل) باستخدام ماسحة قطنية معقمة 15 على حيث نشر الا طباق بشكل متجانس ثم تركت لمدة دقيقة وزعت بعدها ا قراص المضادات 4 الحيوية على الا طباق ثم حضنت في درجة حرارة بعدي ذ ا يام لمدة قيست ا قطار مناطق التثبيط وتم تحديد المضادات الفعالة ضد هذه البكتريا اعتماد ا على الجداول الخاصة باختبارات الحساسية المعتمدة عالمي ا (14,13,12). 69

5 د. محمود زكي الحس و & محمد ا براهيم الطاي ي النتاي ج والمناقشة المعروفة بتخصصها العاي لي. leguminosarum bv.viciae بكتريا تم عزل الشديد لنبات الباقلاء (15) من العقد المتكونة على جذور هذا النبات على وسط YEM الصلب حيث ظهر النمو بعد مرور 5 ا يام من التحضين ونقيت هذه العزلة بطريقة التخطيط على الوسط الا بيض ولونها با حجامها المتوسطة المستعمرات امتازت للحصول على مستعمرات مفردة. وكونها ذات حواف غير منتظمة (الصورة 1) وا ثبت صبغها بصبغة گرام ا نها عصيات قصيرة وا ظهرت نتاي ج سالبة لصبغة گرام وهذه صفات بكتريا.. leguminosarum bv.viciae اختبار التلقيح الاصطناعي بعد مرور (40) يوم ا من زراعة بذور الباقلاء في التربة المعقمة الملقحة ببكتريا. leguminosarum bv.viciae لوحظ تكون العقد الجذرية في النباتات الملقحة وعدم تكونها في النباتات غير الملقحة وهذا دليل على تخصصها لعاي لها وتكوين العقد الجذرية في (16). جذور نبات الباقلاء وا نها تنتمي للنوع. leguminosarum bv.viciae الصورة نمو بكتريا. leguminosarum bv.viciae على وسط (YEM) الصلب (1) بطريقة التخطيط 70

6 تقدير حساسية بكتريا... hizobium leguminosarum bv.viciae بعد ا جراء اختبار الحساسية بطريقة الانتشار بالا قراص (الجدول 1) ا ظهرت العزلة المختبرة التابعة للنوع. leguminosarum bv.viciae مقاومة واضحة للعديد من مضادات البيتا لاكتام حيث ا ظهرت هذه العزلة مقاومة ل( 11 ) نوع ا من المجموع الكلي للمضادات البالغ (14) ا ي بنسبة (%78.6) وا ظهرت حساسيتها ل( 3 ) ا نواع فقط هي Cefoperazone Ceftriaxone Imipenem ا ي بنسبة %21.4 (الصورة.(2. leguminosarum bv.viciae لمجموعة الجدول (1) بكتريا حساسية مضادات البيتا لاكتام المضاد الحيوي التركيز النتيجة (مايكروغرام/قرص) S 75 S S 10 (اعتماد ا على جداول الحساسية في المصدر 14) Amoxicillin Aztreonam Carbencillin Cefepime Cefixime Cefoperazone Cefotaxime Ceftazidime Ceftizoxime Ceftriaxone Cefuroxime Cephalexin Cephradine Imipenem = مقاومة S =حساسة (Ceftriaxone Cefotaxime Cefepime Aztreonam Ceftazidime Cephalexin Cefpoerazone Cefizoxime Cefixime Cephradine : S 20mm, 16mm) (Amoxicillin& Carbencillin: S 16mm, 13mm) Imipenem ( S 22mm, 19mm) Cefuroxime ا ن هذه النتاي ج تشير بوضوح ا لى ا ن بكتريا. leguminosarum bv.viciae لها القدرة على مقاومة العديد من مضادات البيتا لاكتام بما فيها سيفالوسبورينات الجيل الثالث التي تستخدم حالي ا في علاج كثير من الحالات المرضية نظر ا لفعاليتها وطيفها الواسع لاسيما ضد الا نواع البكتيرية المقاومة للمضادات الا خرى (5). 71

7 د. محمود زكي الحس و & محمد ا براهيم الطاي ي الصورة (3) حساسية بكتريا. leguminosarum bv.viciae لمضادات البيتا لاكتام Ceftazidime.6 Cephalexin.5 Cefpoerazone.4 Amoxicillin.3 Cefuroxime.2 Carbencillin.1 Cephradine.12 Ceftriaxone.11 Cefotaxime.10 Cefepime.9 Aztreonam.8 Imipenem.7. Cefizoxime.14 Cefixime.13 ا ن المقاومة التي ا ظهرتها بكتريا. leguminosarum bv.viciae لغالبية مضادات البيتا لاكتام قد تعزى ا لى تعرضها للمضادات المتواجدة في التربة كما ا ن كونها احد البكتريا المكونة لمايكروفلورا الرايزوسفير على وجه التحديد قد يفسر هذه المقاومة. فهذه البكتريا ربما تكيفت وتا قلمت مع وجود العديد من المواد الضارة لها في التربة والمن تجة من قبل الا حياء المجهرية الا خرى المتواجدة في التربة كالفطريات والاكتينومايسيتات التي تنتج المضادات الحيوية ومنها مضادات البيتا لاكتام لذا فان هذه البكتريا ولغرض بقاي ها واستمرارها بالقيام بدورها في تثبيت النتروجين الجوي وتكوين العقد الجذرية قد طورت ا ليات معينة تمكنها من مقاومة هذه المضادات وقد تكون ا هم هذه الا ليات ا نتاجها لا نزيمات البيتا لاكتا ميز β-lactamases التي تعمل على تحطيم مضادات البيتا-لاكتام وتحويلها ا لى شكل غير مو ثر على الخلية وان هذه الا نزيمات غالب ا ما تشفر لها جينات محمولة على الكروموسوم البكتيري وفي بعض الا حيان قد تحمل على البلازميدات ا يض ا وتصبح قابلة للانتقال مابين السلالات المختلفة مكسب ة ا ياها صفة المقاومة (12). ا ن الباحثان Cole و (17) Elkan درسا حساسية (48) عزلة تابعة للنوع. japonicum ل( 8 ) ا نواع من المضادات الحيوية ووجدا ا ن (%60) منها كانت مقاومة 72

8 تقدير حساسية بكتريا... hizobium leguminosarum bv.viciae لمضادات Erythromycin و Polymyxin B Chloramphenicol (%47) منها كانت مقاومة لمضادات Penicillin G و Neomycin كما وجدا ا ن (%25) من العزلات ا ظهرت صفة المقاومة المتعددة Multiple resistance لمضادات Chloramphenicol Penicillin G Tetracycline المتعددة في هذا النوع الذي هو من Streptomycin واستنتجا من ذلك بكتريا التربة وليس من البكتريا ا ن المرضية يشير تواجد المقاومة ا ن ا لى استخدام المضادات علاجي ا لا يكون بالضرورة السبب في تطور ونشوء المقاومة للمضادات بين البكتريا. كما ذكرا في دراسة ا خرى. japonicum وان المقاومة التلقاي ية ا ن المقاومة للمضادات تحدث في البكتريا بغياب الضغط الانتخابي المباشر كما وجدا لمضادات كروموسومي هي الصفة الشاي عة في عزلات Simultaneous esistance لعدة مضادات يمكن Penicillin G Neomycin Chloramphenicol مشابه لذلك الموجود في العاي لة المعوية البلازميدات كما تمكن الباحثان ا علاه بكتريا ا ن ا ن مقاومة عزلات هذه البكتريا كانت مرتبطة بعنصر خارج Enterobacteriaceae في في نفس البحث من نقل صفة المقاومة ا شارة ا لى ا لى بكتريا Agrobacterium من خلال عملية الاقتران وهذه الا دلة تشير بوضوح ا لى وجود جينات المقاومة على بلازميد قابل للانتقال (18). Transmissible Plasmid وذكر الباحث. leguminosarum bv.viciae ا ن عدة سلالات تابعة للنوع (19) Schwinghamer والنوع عند. trifolii ا ضافة مضادات عليه بتراكيز بلغت و ا ظهرت المقاومة للمضادات الحيوية وبتراكيز عالية حيث لم يثبط نموها Oxacillin, Chloramphenicol, Polymyxin B (250,150,120) مايكروغرام / مقاومة للبنسلين في حين ا ظهرت الحساسية لمضاد ا لى الوسط النامية مل على التوالي وكانت جميع العزلات Kremer ووجد الباحثان. Tetracycline (20) Peterson ال جنس بكتريا ا ن hizobium التابعة لا نواع مختلفة ا ظهرت مقاومة واضحة للبنسلين وتباينت حساسيتها تجاه المضادات المختلفة وفيما يخص النوع Penicillin G فقد كانت حساسة لمضادات. leguminosarum bv.viciae Kanamycin Streptomycin وحساسة لمضاد.Tetracycline وفي دراسة ا خرى تم اختبار بكتريا حساسية المثبطة الدنيا. japonicum لعدة (MIC) لها وقد وجد الباحثون ا نواع من مضادات البيتا ا ن هذه العزلة ا ظهرت لاكتام من خلال قيم التراكيز مرتفعة بلغت لتراكيز تحم لا ا كثر من (128 مايكروغرام / مل ( بالنسبة لمضاد Piperacillin وا كثر من (16 مايكروغرام / مل) لمضاد Ceftazidime و (16 مايكروغرام / مل) لمضاد Meropenem وقد ا شاروا 73

9 د. محمود زكي الحس و & محمد ا براهيم الطاي ي ا لى ا ن هذه المقاومة قد تعزى ا لى وجود ا نزيمات البيتا لاكتاميز ا و بروتينات رابطة للبنسلين Penicillin Binding Proteins ذات ا لفة قليلة للارتباط بالمضادات ا و وجود حواجز تقلل من دخول المضادات ا و ا ليات ا خرى تعمل على طرح المضاد للخارج( 12 ). ا ن النتاي ج ا علاه تشير بوضوح ا لى امتلاك بكتريا ال hizobium بمختلف ا نواعها القدرة على مقاومة المضادات الحيوية بما فيها مضادات البيتا لاكتام. ا ما كيفية حدوث هذه المقاومة والا ليات التي تستخدمها هذه البكتريا في ا ظهار المقاومة للمجاميع المختلفة من المضادات الحيوية فهو ا مر يحتاج ا لى المزيد من الدراسة. المصادر 1. Sharif, T., Khalil, S. and Ahmad, S. Pak. J. Biol. Sci., 6(18): (2003). الكسندر مارتن. "مقدمة في مايكروبيولوجيا التربة". جون وايلي وا ولاده نيويورك.2 الولايات المتحدة الا مريكية (1982). قاسم غياث محمد وعلي مضر عبد الستار. "علم ا حياء التربة المجهرية". مديرية دار.3 الكتب للطباعة والنشر الموصل (1989). 4. Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Janda, W. M.; Schreckenberger, P. C. and Winn, W. C., "Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology". Lippincott-aven Publishers, Philadelphia, USA, (1997). 5. Brooks, G. F.; Butel, J. S. and Morse, S. A. "Jawetz, Melnick & Adelberg s Medical Microbiology". 22 nd ed., Lange Medical Books/ McGraw-Hill Inc., USA, (2001). 6. Laurence, D.. and Bennett, P. N. "Clinical Pharmacology".6 th ed., Churchill Livingstone, England, (1990). 7. Prescott, L. M.; Harley, J. P. and Klein, D. A. "Microbiology". 3 rd ed., Wm.C. Brown Communication, Inc., Iowa, USA, (1996). 74

10 تقدير حساسية بكتريا... hizobium leguminosarum bv.viciae 8. Kucuk, C.; Kivanc, M. and Kinaci, E. Tvk: Tak, Turkey, 2: (2006). 9. Baron, E. J.; Peterson, L.. and Finegold, S. M., "Bailey & Scott s Daignostic Microbiology". Mosby-Year Book, Inc. USA, (1994). 10. Saydam, C. M.; Copen, and Sezgin, E. J. Turk. Phytopathol., 2:69-75 (1973). 11. Motealegre, J.; eyes, ; Perez. L.; Herrera,.; Silva, P. and Besoain, X. Elec. J. Biotech., 6 (2): (2005). 12. Stoczko, M.; Frere, J.; ossolini, G. and Docquier, J. Antimicro. Agents Chemother., (2006). 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS. "Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests"; Approved Standards-8 th ed., M2-A8, Vol.20, No.1, NCCLS, Wayne, PA, USA, (2003). 14. National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS. "Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 14 th Informational Supplement". M100-S14, Vol.24, No.1, NCCLS, Wayne, PA, USA, (2004). 15. Harvath, B.; Bachem, W.; Schel, J. and Kondorosi, A. EMBO J., 4(7): (1987). 16. Vincent, J. The genus hizobium. In: Starr, M. P.; Stolp, H.; Truper, H. G.; Balows, A. and Schilegel, H. G.(eds). The Prokaryotes. Vol.1, Springer-Verlang, USA, pp (1981). 17. Cole, M. and Elkan, G. Appl. Envir. Microbiol., 14(6): (1979). 18. Cole, M. and Elkan, G. Antimicrob. Agents Chemother.,11(5): (1973). 19. Schwinghamer, A. Antonie Vanleewenhoek J. Microbiol. Serol., (1967), cited by Cole, M. and Elkan, G. Appl. Envir. Microbiol., 14(6): (1979). 20. Kremer,. and Peterson, H. Appl. Enviro. Microbiol., 17(6): (1982). 75